الثلاثاء، 22 نوفمبر 2016

العوامل المؤثرة على النمو الميكروبي

تقدير النمو الميكروبي
أ‌-      تقدير الوزن الجاف للنمو الفطري  (  (Dry weight 

الطرق المعملية لقياس معدل النمو في الفطريات:
لقياس معدل نمو الفطريات على البيئات الصلبة نستخدم قياس قطر المستعمرة  أما على البيئات السائلة نستخدم طريقة الوزن الجاف .
1- طريقة قياس قطر المستعمرة:
وهي من أكثر الطرق شيوعا وتتم عن طريق تلقيح منتصف الأطباق المحتوية على بيئة تشابك دوكس بواسطة أقراص منتظمة من مزرعة فطرية حديثة العمر يتراوح عمرها (7-14يوم) ثم تحضن في درجة حرارة 25م° أو في جو المعمل لمدة أسبوع مع مراعاة أخذ قياس قطر المستعمرة على فترات منتظمة وذلك بعمل خطين متعامدين على قاعدة الطبق وقياس كلاً منها وأخذ المتوسط.
من سلبيات هذه الطريقة أنها تهمل سمك الميسليوم النامي في الطبق فبعض الفطريات قد لاتتوسع في النمو بشكل أفقي بقدر توسعها فيه بشكل رأسي.
2- طريقة الوزن الجاف:
وتعتبر هذه الطريقة من أحسن الطرق وأدقها وفيها يوزن الميسيليوم الفطري بجراثيمه وذلك بترشيح مكونات البيئة الغذائية مع النمو الفطري ويجب مراعاة غسل الميسيليوم الفطري وضغطه وذلك للتخلص من بقايا البيئة العالقة به ثم يجفف الميسيليوم في أفران خاصة عند درجة حرارة 80ـ110 م° ويوزن الميسيليوم بعد التجفيف  على ميزان حساس ويكتفى بتقريب الوزن أقرب ملجم . وهذه الطريقة تستعمل عادة مع المنابت السائلة.

أسم التجربة: تقدير الوزن الجاف للنمو الفطري. 

نوع الميكروب :
Alternaria , Fusarium

الادوات : 6 دوارق مخروطية تحتوي على بيئة مناسبة سائلة ومعقمة – ورق ترشيح – ثاقب فليني – ميزان حساس – فرن تجفيف – مزارع فطرية نقية.


طريقة العمل:
1-  تحضر عدد 6 دوارق لكل مجموعة تحتوي على بيئة تشابك دوكس سائلة.
2-  تحت شروط التعقيم ، يتم تلقيح البيئات السائلة  بواسطة قرصين من مزرعة فطرية نقية حديثة العمر.
3-  تحضن الدوارق عند درجة حرارة 25م° لمدة 2 فلاسكة لمدة 3 أيام ، 2 فلاسكة لمدة 5 أيام و 2 فلاسكة لمدة 7 أيام .
4-  بعد اول فترة تحضين ( 3 أيام ) يرشح النمو الفطري على ورقة ترشيح معلوم الوزن.
5-  يغسل النمو الفطري بالماء المقطر ويجفف بالضغط عليه بورقة الترشيح.
6-  يوضع النمو الفطري في فرن درجة حرارته (80 م°) لمدة 48 ساعة. ونقيس الوزن كل يوم حتى نصل لوزن ثابت وهذا ما يقدر بالوزن الجاف  Dry weight بالجرام.
7-  يتم حساب الوزن الجاف للفطر كالآتي:
الوزن الجاف للفطر=(وزن ورقة الترشيح+وزن الفطر) – وزن ورقة الترشيح
8-  تكرر الخطوات السابقة  لكل فلاسكتين بعد فترات التحضين 5 , 7 أيام من بدء التجربة. بعدها تسجل النتائج وتمثل بيانياً برسم منحنى يوضح العلاقة بين الوزن الجاف وكمية النمو.
ملاحظة:  كلما زادت فترة التحضين زاد النمو الفطري إلى حد معين يبدأ بعده النمو في التدهور والانحلال.

النتائج:


ب-تقدير درجة التعكير للنمو البكتيري ( Turbidity method)

عندما تنقسم الخلايا البكتيرية يؤدي إلى وسط معكر وكلما زادت درجة تعكير المزرعة البكتيرية زادت كمية النمو لذلك تستخدم طريقة تقدير درجة التعكير للنمو البكتيري التي تعتبر من الطرق غير المباشرة لتقدير النمو، وهي من الطرق الكثيرة الاستعمال لسرعتها و دقتها إلا أنها يعاب عليها أنها تقدر الخلايا الحية و الميتة معا و لا يمكن استعمالها في حالة المواد الملونة بعمق كبير أو التي تحتوى على مواد أخرى عالقة غير الخلايا البكتيرية. الأساس في هذه الطريقة  أنه عندما يمر شعاع ضوئى فى معلق بكتيري فان جزء منه يمتص بواسطة المعلق، و بذلك فان كمية الأشعة النافذة من المعلق تتناسب عكسيا مع كثافة هذا المعلق، اى كلما زاد تعكير البيئة نتيجة زيادة النمو كلما قلت قراءة الجهاز، بمعنى أن القراءة تكون متناسبة عكسيا مع عدد الخلايا، و يقاس الضوء النافذ باستعمال وحدة ضوئية حساس  في جهاز مناسب مثل جهازTurbidimeter, .Spectrophotometer

طريقة العمل:
1.  نحضر مزرعة حديثة من E.coli نامية على بيئة سائلة.
2.  نقوم بتخفيف العينة (10:1   100:1  1000:1 10000:1 ) ونضعها في الانابيب الخاصة بجهاز قياس اللون ونضع نفس الكمية من البيئة المستخدمة في التنمية كعينة كنترول.
3.  في حالة استعمال بيئة عديمة اللون يكون الطول الموجي عند 420 نانوميتر  وفي حالة استعمال بيئة صفراء او بنية يستعمل طول موجي 600 نانوميتر.
4.  يتم استخلاص النتائج بعمل منحنيات قياسية Standard curves تربط بين القراءات المأخوذة و البيانات الأخرى المطلوبة مثل عدد الخلايا .



دراسة تاثير العوامل البيئة على النمو الميكروبي
العوامل البيئية:
1- عوامل فيزيائية (physical factors)
2- عوامل كيميائية (chemical factors)
3- عوامل حيوية (Biological factors)

اولا : العوامل الفيزيائية:
أ-دراسة تأثير درجة الحرارة على النمو الميكروبي Effect of temperature:
درجة الحرارة من أهم العوامل المؤثرة على فسيولوجيا الكائنات الدقيقة حيث أنها تؤثر على نشاط الانزيمات وذلك يرجع للطبيعة البروتينية للانزيمات . ولكل نوع ميكروبي ثلاث درجات من الحرارة هي:
1-درجة الحرارة الدنيا Minimum temperature:
هي أقل درجة حرارة تستطيع البكتيريا أن تنمو عندها بحيث إذا انخفضت درجة الحرارة عنها فإن البكتيريا لا يمكنها النمو.
2- درجة الحرارة المثلى Optimum temperature:
هي تلك الدرجة التي تنمو عندها البكتيريا بصورة أفضل ما تكون وتصل سرعة النمو أقصاها وذلك خلال فترة تحضين قصيرة تتراوح بين ( 12- 24 ساعة).
-3 درجة الحرارة العظمى  :Maximum temperature
هي أعلى درجة حرارة تستطيع البكتيريا أن تنمو عندها بحيث إذا ارتفعت درجة الحرارة عنها يتوقف النمو تماما.
* يطلق على المدى بين درجة الحرارة الدنيا (minimum temperature) والقصوى (optimum temperature)، بالنطاق الحراري (Range of temperature).

تأثير درجة الحرارة المنخفضة  على البكتيريا:
عند انخفاض درجة الحرارة تصبح كل النشاطات الحيوية بطيئة جدا لان لزوجة البروتوبلازم تزداد وبالتالي تقل الطاقة الحركية للإنزيم ويقل نشاطه . كذلك تؤثر على الدور الذي يلعبه الغشاء الخلوي في نقل العناصر الغذائية من وإلى الخلية وهذا بدوره ويؤدي إلى انخفاض النشاط الإيضي للخلية .
تأثير درجة الحرارة المرتفعة على البكتيريا:
يؤدي ارتفاع درجة الحرارة إلى تحفيز كل التفاعلات البيوكيميائية في الميكروب لتصل للحد المثالي ثم يحدث العكس حيث تقل ثم تتوقف كل التفاعلات البيوكيميائية نتيجة لتغيير طبيعة الإنزيم ويبدأ التأثير المميت للحرارة والمتضمن فساد للبروتينات الإنزيمية.
تقسم الميكروبات حسب تحملها لدرجة الحرارة إلى :
1-  لأحياء الدقيقة المحبة للحرارة المنخفضة   .Psychrophilic microorganism
2-  الأحياء الدقيقة المتحملة للحرارة المنخفضة   .Psychrotolerant microorganism
3-  الأحياء الدقيقة المحبة للحرارة المتوسطة microorganism Mesophilic.
4-  الأحياء الدقيقة المحبة للحرارة المرتفعة  microorganism Thermophilic.
5-  الأحياء الدقيقة متحملة للحرارة المرتفعة  microorganism Thermotolerant.




اسم التجربة : تقدير درجة الحرارة المثالية لبعض الميكروبات.

نوع الميكروب :
البكتيريا : Bacillus , E.coli
الفطريات: Alternaria , Fusarium

الأدوات : اطباق بتري تحتوي على بيئة ( Nutrient Agar( N.A - إطباق بتري تحتوي على بيئة Potato Dextrose Agar ( PDA) – ابر تلقيح بكتيريا وابر تلقيح الفطريات.

طريقة العمل:
1-  يتم تلقيح 6 اطباق من بيئة ( N.A) بواسطة البكتيريا المختبرة ثم يحضن كل طبق في درجة حرارة مختلفة كالتالي ( 5 , 10, 28, 37, 42 , 55 درجة مئوية ) لمدة 48 ساعة ثم تفحص الإطباق بعد التحضين من حيث النمو.
2-  يتم تلقيح 6 اطباق من بيئة (PDA) بواسطة أقراص من الفطريات المختبرة ثم يحضن كل طبق في درجة حرارة مختلفة كالتالي  ( 5 , 10, 28, 37, 42 , 55 درجة مئوية ) لمدة5-7 أيام ثم تفحص الإطباق من حيث النمو.
3-  دوني في الجدول النتائج المتعلقة بنمو البكتيريا كالتالي -  = لا يوجد نمو ، + = نمو ضعيف ، + + = نمو متوسط ، + + + = نمو غزير.
4-  دوني في الجدول النتائج المتعلقة بنمو الفطريات بتقدير النمو الخطي بالسنتميتر.
5-  ارسمي منحنى يوضح العلاقة بين الدرجات الحرارة المختلفة ومقدار النمو لكل نوع ميكروبي.
6-  حددي درجة الحرارة العليا والمثلى والدنيا لكل نوع ميكروبي.
النتائج:
-       جدول يوضح النتائج المتعلقة بالنمو البكتيري:

-       جدول يوضح النتائج المتعلقة بالنمو الفطري:

اسم التجربة : تقدير معدل موت الخلايا نتيجة ارتفاع درجة الحرارة:

درجة  الحرارة المميتة Thermal death point  : وهي درجة الحرارة التي يموت عندها الميكروب بفعل ارتفاع درجة الحرارة . 
نوع الميكروب :
البكتيريا : Bacillus , E.coli
الفطريات: Alternaria , Fusarium
الأدوات:
أنابيب اختبار فارغة ومعقمة , بيئة
N.A, أطباق بتري , حمامات مائية, ترمومتر, حمام ثلجي.
طريقة العمل:
1- يوضع 1 مل من المعلق البكتيري في 6 أنابيب فارغة , يوضع 1 مل من المعلق الفطري في 6 أنابيب فارغة.
2- اتبعي الخطوات التالية لكل من الأنابيب المحتوية على المعلق البكتيري والفطري:
توضع أحد الأنابيب في حمام مائي درجة حرارتة 45 م° لمدة 10 دقائق
توضع الأنبوبة الثانية في حمام مائي درجة حرارتة 55 م° لمدة 10 دقائق
توضع الأنبوبة الثالثة في حمام مائي درجة حرارتة 60 م° لمدة 10 دقائق
توضع الأنبوبة الرابعة في حمام مائي درجة حرارتة 80 م° لمدة 10 دقائق
توضع الأنبوبة الخامسة في حمام مائي درجة حرارتة 100 م° لمدة 10 دقائق
تترك الأنبوبة السادسة بدون تعريض للحرارة للمقارنة بعد المعاملة الحرارية توضع الأنابيب في حمام ثلجي.
3- نفرغ محتويات الأنابيب في الأطباق وتصب البيئة على الأطباق وتحرك حركة دائرية برفق.
4- تحضن الأطباق عند 37 م°للبكتيريا لمدة 48 ساعة و28 م° للفطر لمدة 5-7 أيام.
5- دوني في الجدول النتائج المتعلقة بنمو البكتيريا والفطر كالتالي -  = لا يوجد نمو ، + = نمو ضعيف ، + + = نمو متوسط ، + + + = نمو غزير. مع مقارنة النتائج مع الكنترول.
6-ارسمي منحنى يوضح العلاقة بين الدرجات الحرارة المختلفة ومقدار النمو لكل نوع ميكروبي.وحددي درجة الحرارة المميتة.


النتائج:
-       جدول يوضح النتائج المتعلقة بالنمو الميكروبي:


ليست هناك تعليقات:

إرسال تعليق